Funktionelle Charakterisierung einer Matrix Metalloproteinase aus Tomate (PDF)

Matrix Metalloproteinasen (MMPs) steuern in zoologischen Systemen zahlreiche
physiologische Prozesse, wie Embryogenese, Organogenese, Wundheilung, Zellteilung und –
differenzierung. Ihre Fehlregulation führt zur Entstehung bedeutender Krankheiten wie z.B.
Arteriosklerose und Krebs. In Pflanzen hingegen ist die Funktion der Enzyme erst
ansatzweise verstanden bzw. in Tomatenpflanzen noch ungeklärt.
Die biochemischen Eigenschaften der MMP1 aus Tomate (SlMMP1) wie auch der jüngst
identifizierten SlMMP2 sind bekannt und deuten auf eine redundante Funktion der beiden
Proteine in vivo hin. Die Aufklärung dieser Funktion stand im Mittelpunkt der vorliegenden
Arbeit.
Für SlMMP1 und 2 wird die Verankerung in der Plasmamembran über einen
Glycosylphosphatidylinositol- (GPI-) Anker prognostiziert. In SlMMP1 überexprimierenden
Zellkulturen und transgenen Pflanzen konnte eine Assoziation mit Membranpräparationen
bestätigt werden. Für ein SlMMP1-GFP-Fusionsprotein wurde die Lokalisation in der
Plasmamembran gezeigt. Die GPI-Verankerung konnte nicht zweifelsfrei nachgewiesen
werden, jedoch wurde eine für diese Verankerung typische Abspaltung von der Membran
(„shedding“) beobachtet.
Wesentlich für die physiologische Aufgabe sind die Substrate von Proteasen. Im Rahmen
dieser Arbeit konnte eines der in vivo-Substrate von SlMMP1/2 identifiziert werden. Dabei
handelt es sich um die extrazelluläre Subtilase P69B aus Tomate, die von beiden MMPs in
vitro gespalten wird.
In transgenen Pflanzen, die die MMPs aufgrund von RNA-Interferenz nicht exprimieren
(RNAi-Pflanzen), kommt es zu einer massiven Akkumulation von P69B. Die RNAi-Pflanzen
zeigen einen auffälligen Phänotyp, welcher sich in nekrotischen Läsionen v.a. an
Hypokotylen äußert, doch können Zelltodereignisse darüber hinaus auch im Rest der Pflanzen
beobachtet werden. Die transiente Expression von P69B in Blättern von Tomaten- und
Tabakpflanzen bestätigte die Beteiligung der Subtilase am kontrollierten Zelltod. Die
Beobachtungen deuten darauf hin, dass SlMMP1 und 2 indirekt über die Spaltung von P69B
eine Kontrolle über den Zelltod ausüben. Dies steht auch im Einklang mit der für P69B
beschriebenen Rolle in der Pathogenabwehr.
Bestätigung fanden diese Befunde durch die Analyse der Proteome von Wildtyp- und MMPRNAi-
Pflanzen über 2D-DIGE. In RNAi-Pflanzen konnte die Anreicherung von P69B
nachgewiesen werden. Darüber hinaus erwiesen sich zahlreiche an der Stressantwort
beteiligte Proteine als signifikant hochreguliert. Hierbei handelte es sich um „klassische“ PR-
Proteine, Endochitinasen, Peroxidase und weitere. Auffällig war weiterhin die an der Ethylen-
Biosynthese beteiligte Methionin-Synthase. Das angesprochene Phytohormon spielt eine
entscheidende Rolle in Stressreaktionen; seine deutlich erhöhte Biosynthese in MMP-RNAi-
Pflanzen konnte bereits nachgewiesen werden.
Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen den Schluss zu, dass es sich bei Matrix
Metalloproteinasen in Tomaten um entscheidende Faktoren bei der Reaktion auf Pathogene
sowie der Organisation des Apoplasten handelt. Neben dem Phänotyp der RNAi-Pflanzen
bieten die hier vorgestellten Ergebnisse proteomischer Analysen hervorragende Ansatzpunkte
für eine nähere Charakterisierung der Proteinfamilie.