Klonierung der Kodierungssequenz der kleinen Einheit der Methylamin-Dehydrogenase aus Hyphomicrobium zavarzinii ZV 580 (PDF)

Bachelorarbeit aus dem Jahr 2009 im Fachbereich Biologie - Mikrobiologie, Molekularbiologie, Note: 1,3, Universität Bayreuth, Sprache: Deutsch, Abstract: Der Organismus Hyphomicrobium zavarzinii ZV580 ist ein gram-negatives Bakterium, welches nach wie vor großes Forschungspotential bietet, da viele Stoffwechselwege und die daran beteiligten Enzyme bis jetzt nicht vollständig aufgeklärt worden sind. Neben einer bereits bekannten NAD+-unabhängigen, hochspezifischen Formaldehyd-Dehydrogenase besitzt es zudem eine Methylamin-Dehydrogenase. Dehydrogenasen katalysieren zahlreiche Reaktionen und sind auch in der Technik vielseitig einsetzbar, wie beispielsweise in elektrochemischen Biosensoren, die aufgrund ihrer umweltschonenden Arbeitsweise zunehmend an Aufmerksamkeit gewinnen. Die Methylamin-Dehydrogenase, welche für den Organismus Hyphomicrobium zavarzinii ZV580 beschrieben wurde, ist ein lösliches Quinoprotein, das die Umwandlung von Methylamin zu Formaldehyd katalysiert. Es setzt sich aus zwei Untereinheiten zusammen und besitzt den chinoiden Co-Faktor TTQ (Tryptohan Tryptophylquinon). Möglicherweise handelt es sich bei dem Enzym um eine der seltenen a, ß-Methylamin-Dehydrogenasen. Wie alle Enzyme katalysiert auch die Methylamin-Dehydrogenase bei umkehrbaren Reaktionen die Gegenreaktion, in diesem Fall die Reduktion von Formaldehyd zu Methylamin. Dies macht sie zu einem potentiellen Kandidaten als Katalysator in einem Biosensor. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Teil der kleinen Untereinheit der Methylamin-Dehydrogenase aus Hyphomicrobium zavarzinii ZV580 kloniert um dadurch einen Ansatzpunkt für weiterreichende Aufklärungen der vollständigen Sequenz und somit auch regulatorischer Elemente für eine Expression zu schaffen. Für die Klonierung wurden drei verschiedene Primer-Paare, welche aus der N-Sequenzierung der bereits isolierten kleinen Einheit der Methylamin-Dehydrogenase M58001 aus dem Organismus Thiobacillus versutus hervorgegangen sind, bei unterschiedlichen Temperaturen mit einem Matrizenstrang hybridisiert. Dabei erhielten die PCR-Produkte einen Adenosin-Überhang und konnten anschließend in einen Vektor, welcher komplementäre Thymidin-Überhänge aufwies, ligiert und in kompetente E.coli Zellen transformiert werden. Nach der Isolierung und anschließenden Sequenzierung der erhaltenen Plasmid-DNA war es möglich eine 64 Aminosäuren umfassende Sequenz zu erhalten, welche eine Homologie von 93 % zu der Sequenz bereits isolierter und kristallisierter Untereinheiten der Methylamin-Dehydrogenase zeigt.