Präparation und Charakterisierung von klonalen, neuralen Zelllinien, welche das EGFP-Tau-Fusions-Protein stabil exprimieren (PDF)

Inhaltsangabe:Einleitung:
Das Zytoskelett ist eine der wichtigsten Determinanten der neuronalen Zytoarchitektur. Wechselwirkungen zwischen dem neuronalen Membrankortex und den Filamenten des Zytoskeletts sind wahrscheinlich stark an der Entwicklung und Degeneration von Nervenzellen beteiligt.
Die Fusion von Proteinen mit Fluorophoren wie EGFP ist eine geeignete Methode, um die Verteilung dieser Proteine innerhalb der lebenden Zelle zu beobachten. Die Entwicklung von stabil transfizierten PC12-Zellen mit einem EGFP-Tau-Fusionskonstrukt ermöglicht es daher, die Expression und subzelluläre Verteilung von Tau in lebenden Zellen zu studieren.

Ziel des Projektes war es zunächst, klonale, also genetisch identische Zelllinien zu erhalten, welche konstitutiv das EGFP-Tau-Fusionsprotein überexprimieren. Dafür war es notwendig die Zellen durch Einzelzellverdünnnungsexperimente aus einem Gemisch unterschiedlicher Zelltypen zu isolieren. Die so erhaltenen Zellklone sollten durch protein-biochemische Methoden auf den Grad der Überexpression und das Vorhandensein vollständiger Fusionskonstrukte überprüft werden.
Immunfluoreszenzmikroskopische Beobachtungen der Ausgangskultur legten im Verlaufe des Projektes schließlich nahe, das Ziel des Projektes neu zu definieren. Nunmehr sollte der Nachweis geführt werden, ob Schwankungen in der Expression des EGFP-Tau-Fusionsproteins durch den Zellzyklus bedingt waren oder durch andere Faktoren beeinflusst wurden. Außerdem sollte überprüft werden, ob die Zellen der Ausgangskultur das Fusionskonstrukt funktionell korrekt und vollständig exprimieren. Weiterhin sollte untersucht werden, ob das EGFP-Tau-Fusionsprotein mit den Mikrotubuli assoziiert.

Inhaltsverzeichnis:Inhaltsverzeichnis:
Inhaltsverzeichnis6
Abkürzungsverzeichnis8
Einleitung11
1.Das Zytoskelett12
2.Die Mikrotubuli12
3.Das Protein Tau13
4.Neurodegenerative Erkrankungen15
5.Die PC12-Zelllinie17
6.Das ¿Enhanced Green Fluorescent Protein¿ (EGFP)18
7.Fragestellung und Ziel der Arbeit19
Material und Methoden21
1.Materialen und Geräte21
1.1Chemikalien21
1.2Verwendete Zelllinien21
1.3Puffer, Medien, Lösungen22
1.3.1Zellkultur22
1.3.2Immunfluoreszenzmikroskopie24
1.3.3Biochemische Analysen27
1.4Antikörper und Chemikalien zur Färbung30
1.4.1Primäre Antikörper30
1.4.2Sekundäre Antikörper31
1.4.3Chemikalien zur [...]