Selektive Modifikation von DNA durch kupferkatalysierte 1,3-Dipolare Cycloaddition (PDF)

Die Einführung von funktionellen Gruppen in DNA unter Erhaltung der Basenpaarung und enzymatischen Prozessierbarkeit ist eine wichtige Möglichkeit DNA mit neuen Eigenschaften für neue Anwendungen zu erzeugen. Ziel der Arbeit war die Funktionalisierung von DNA mit Aldehyden zur Abscheidung von Silber mit Hilfe der Tollens-Reaktion. Dabei wurde nicht nur der direkte Einbau von aldehydmodifizierten Monomeren, sondern auch die Funktionalisierung von DNA mit Hilfe der Kupfer(I)-katalysierten 1,3-dipolaren Cycloaddition von Aziden und Alkinen („Click“-Chemie) untersucht. Diese erst vor kurzem entdeckte Reaktion zeichnet sich durch hohe Geschwindigkeit, hohe Ausbeute, hohe Toleranz funktioneller Gruppen und einfache Durchführung aus. Die Reaktion wurde schon in vielen Bereichen der Chemie und Biochemie erfolgreich eingesetzt.
Um die Kompatibilität der Reaktion mit DNA zu untersuchen, wurden mit Alkinen modifizierte Thymidine über Festphasensynthese in kurze DNA-Stränge eingebaut. Bei der Untersuchung der Produkte der Cycloaddition unter verschiedenen Bedingungen zeigte sich, dass die Stabilisierung der Cu(I)-Ionen durch spezielle Liganden, wie Tribenzyltriazolamin (TBTA), nötig war. Die direkte Zugabe von CuBr als Kupfer(I)-Quelle ohne Reduktionsmittel ergab die besten Ergebnisse. Mit diesen Bedingungen gelang es, sechs aufeinanderfolgende Alkine quantitativ mit verschiedenen Aziden umzusetzen. Die Bandbreite der eingeführten Funktionen reichte von Fluoreszenzfarbstoffen wie Fluoreszein bis hin zu metallreduzierenden Gruppen, wie Zucker. Ein gewisser Abstand des Alkins zur Base war bei den Einzelsträngen für eine quantitative Umsetzung essentiell. Selbst die Reaktion an bis zu 2000 Basenpaare langen DNA-Strängen mit nur jeweils zwei Alkinen konnte ohne Schädigung der DNA durchgeführt werden.
Alkin-DNA wurde außerdem erfolgreich im microcontact printing auf azidmodifizierten Glasoberflächen verwendet. Um die DNA ohne Störung ihrer Struktur zu immobilisieren, wurden neue Festphasenmonomere für terminale Alkine synthetisiert. Diese Alkin-DNA wurde danach auf der Oberfläche erfolgreich mit einem fluoreszenzmarkierten Gegenstrang hybridisiert.
Zur Herstellung von langen DNA-Strängen (2000 Basenpaare) mit einer hohen Dichte an Aldehyden wurden Triphosphate mit Aldehyden oder Alkinen synthetisiert. Diese substituierten das entsprechende natürliche Triphosphat in der PCR. Bei den Aldehyd-Triphosphaten war die Freisetzung der Aldehyde, welche als Acetale geschützt waren, nicht ohne Schädigung der DNA möglich. Ein Baustein mit einem acetylgeschützten Zucker als Aldehydkomponente zeigte selektive Metallabscheidung. Diese sterisch anspruchsvollen Substrate erwiesen sich allerdings als schlechte Substrate für die Polymerasen in der PCR.
Triphosphate mit Alkinen wurden deutlich besser von den Polymerasen akzeptiert. So wurden mit 5-(1,7-Oktadiinyl)-2'-desoxyuridin- oder 5-(1,7-Oktadiinyl)-2'-desoxycytidintriphosphat PCR-Produkte mit bis zu 2000 Basenpaare Länge mit fast 900 Alkinen hergestellt. Die Alkin-Basen führten zu einer deutlichen Stabilisierung der DNA. Funktionalisierung der PCR-Produkte mit einem Galaktoseazid und anschließender enzymatischer Abbau zu den Monomeren zeigte für das Alkincytidin quantitativen Umsatz. Bei PCR-Produkten mit Alkinuridinen reagierten mindestens 95 % der Alkine. Die Aldehyd-DNA konnte durch Silberfärbung auf Polyacrylamidgelen oder Membranen selektiv und sehr empfindlich nachgewiesen werden. Aldehydmodifizierte PCR-Produkte mit Silber oder Gold wurden beschichtet. Mit AFM oder STM wurde die Selektivität und die Qualität der Metallabscheidung untersucht.